本申请公开一种通过NAD+提高牛精子分选后活力的方法，涉及生物技术领域，用于解决流式细胞仪分选精子时会对精子造成损伤的问题。将牛精液稀释到一定浓度；向稀释好的牛精液中添加含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）的分选液，进行孵育染色；将染色完成后的牛精液过筛，一定温度下第一保温一段时间，再进行第二保温一段时间；将第二保温后的精子送至进样舱，通过流式细胞分选仪对X、Y精子进行分选。本发明使用含NAD+的分选液对牛精子进行分选，使NAD+可以快速作用于分选后的X、Y精子上，提高分选后的精子活性，显著改善牛精子在通过性别分选后活力下降的现象。
1.一种通过NAD+提高牛精子分选后活力的方法，其特征在于，包括以下步骤： 采集待分选的牛精液，利用稀释剂将所述牛精液稀释至1×108个/mL； 向稀释后的所述牛精液中添加分选液，在37℃下孵育28～32 min，对所述牛精液进行染色；其中，所述分选液包括所述稀释剂和NAD+，所述分选液中NAD+的浓度为0.1～100μM/mL，余量为稀释剂； 将染色完成后的所述牛精液进行过筛，置于17～20℃恒温箱中进行第一保温20～30min，再置于2～6℃恒温箱进行第二保温20～40 min； 将所述第二保温后的精子送至进样舱，当变异系数达到2%时，通过流式细胞分选仪在无菌条件下，对X、Y精子进行分选； 每100 mL所述稀释剂由以下组分组成：葡萄糖0 .80～1 .20 g、柠檬酸1 .20～1 .50g、Tris 2 .00～2.50 g、双抗0 .8～1 .2 mL、蛋黄液18～22 mL、甘油2～4 mL、Hoechst33342 0 .08～0 .12 mL和胚胎水补齐至100 mL。
2.根据权利要求1所述通过NAD+提高牛精子分选后活力的方法，其特征在于，将染色完成后的所述牛精液进行过筛，置于18～19℃恒温箱中进行第一保温24～26 min，再置于4～5℃恒温箱进行第二保温28～32 min。
3.根据权利要求1所述通过NAD+提高牛精子分选后活力的方法，其特征在于，每100 mL所述稀释剂由以下组分组成：葡萄糖1 .00 g、柠檬酸1 .35 g、Tris 2 .32 g、双抗1 mL、蛋黄液20 mL、甘油3 mL、Hoechst33342 0.1 mL和胚胎水补齐至100 mL。
4.根据权利要求1~3任一所述通过NAD+提高牛精子分选后活力的方法，其特征在于，所述分选液包括所述稀释剂和NAD+，所述分选液中NAD+的浓度为10～30μM/mL，余量为稀释剂。
5.根据权利要求1 ~ 3任一所述通过NAD+提高牛精子分选后活力的方法，其特征在于，所述分选液包括所述稀释剂、NAD+和NMN，所述分选液中NAD+的浓度为0.1～100μM/mL、NMN的浓度为0.1～10μM/mL，余量为稀释剂。
6.根据权利要求5所述通过NAD+提高牛精子分选后活力的方法，其特征在于，所述分选液中NAD+的浓度为10～30μM/mL、NMN的浓度为2～6μM/mL，余量为稀释剂。
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