本发明公开了一种双峰驼转录组微卫星分子标记的多态性引物设计及其筛选方法和用于鉴定双峰驼亲子关系的方法。所述的多态性引物鉴定双峰驼亲子关系的方法包括：利用EDTA抗凝管采集具有亲子关系的双峰驼全血样品，然后采用核酸提取试剂盒法(磁珠法)提取双峰驼基因组DNA；将所述双峰驼转录组微卫星分子标记的多态性引物和所述基因组DNA混合并进行PCR扩增，得到扩增产物；将所述PCR产物进行3730XL型仪器毛细管电泳检测SSR分子标记；对所述结果进行亲子关系分析。
1.用于鉴定双峰驼亲子关系的双峰驼转录组微卫星分子标记的多态性引物，包括： XM_006194104_5177-5222正、反向引物，XM_006191380_1034-1055正、反向引物，XM_006186221_4890-4933正、反向引物，XM_006185105_1253-1274正、反向引物，XM_006184182_1654-1697正、反向引物，XM_006183662_2012-2041正、反向引物，XM_006182535_1080-1115正、反向引物，XM_006182052_4595-4622正、反向引物，XM_006180554_882-917正、反向引物，XM_006177721_2115-2144正、反向引物，XM_006177716_989-1008正、反向引物，XM_006173968_3405-3428正、反向引物，XM_006173207_3661-3682正、反向引物，XM_006172972_1548-1587正、反向引物； 所述引物的具体信息如下(5'到3')： XM_006194104_5177-5222正向引物序列F:GAAACAAGCCTTACTCAT，反向引物序列R:AAGGTGCTATACTTCTGTGA； XM_006191380_1034-1055正向引物序列F:GTCATCACGACGGACTGC，反向引物序列R:CAAGGAGACGCAAGCATT； XM_006186221_4890-4933正向引物序列F:TTCTGGGCAATGATGGGATG，反向引物序列R:AGGAAGGAGGTTCTTTGTCT； XM_006185105_1253-1274正向引物序列F:TGACCACCAAGGAGAAGC，反向引物序列R:CCACGATGGCATAAGGAA； XM_006184182_1654-1697正向引物序列F:CAATCCCGCCTGATTCCT，反向引物序列R:CATTGAGAAGAATAGAGGTGGA； XM_006183662_2012-2041正向引物序列F:AACGTCTGCGTGTATGGC，反向引物序列R:CCCTAAAGTAAAGCAAACCC； XM_006182535_1080-1115正向引物序列F:CAGATAATCAGACCAGCGTTAC，反向引物序列R:AAGCCTTCAATAGTCTTCATC； XM_006182052_4595-4622正向引物序列F:AGTTCAAATCAGTCGTCCTT，反向引物序列R:TGGTAACTCCCTTTGGTA； XM_006180554_882-917正向引物序列F:AAGCAGGTGTTTGATTTGT，反向引物序列R:CCAGGGAGAATGGAGAATA； XM_006177721_2115-2144正向引物序列F:TCTGTGCCACGCCCTTAC，反向引物序列R:AAGGACACCAGGGAAACTAG； XM_006177716_989-1008正向引物序列F:ACTGGCACAACTGGAAGC，反向引物序列R:ATTGGTGGAAACAGAACA； XM_006173968_3405-3428正向引物序列F:CCTGGACGGCAGTGATAG，反向引物序列R:TAATCCCTTACTCCCTGAAAA； XM_006173207_3661-3682正向引物序列F:ATAGAAGCATGTCGGTAG，反向引物序列R:CCCTCTGCTGGCACTGAA； XM_006172972_1548-1587正向引物序列F:CGCTGGGACAGCTAAGAC，反向引物序列R:CTTTCTGGTAAAGGCAAC。
2.权利要求1所述的多态性引物的筛选方法，包括： 通过双峰驼的转录组序列筛选SSR位点，得到双峰驼微卫星分子序列，设计引物，通过琼脂糖凝胶电泳筛获得粗选的双峰驼微卫星分子标记的多态性引物并进行荧光标记； 采用核酸提取试剂盒法提取不同群体双峰驼基因组DNA； 将所述粗选的多态性引物和所述基因组DNA混合并进行PCR扩增，得到扩增产物； 再将变性的混合液采用3730xl设备进行毛细管电泳，用GeneMapper 4.0软件进行分子量标准校对和微卫星基因型分型，筛除等位基因数小于等于4或出现极端分布的引物，得到权利要求1所述的双峰驼转录组微卫星分子标记的多态性引物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR引物为正向引物5’端带有荧光标记的荧光引物，其荧光标记选自HEX-绿色、FAM-蓝色或TAM-黄色。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR扩增体系包括：模板基因组DNA 1μL，10×Taq Buffer，10mM dNTPs，25mM MgCl2，5U Taq DNA聚合酶，10μM所述双峰驼转录组微卫星分子标记的多态性引物，所述PCR扩增体系的总体积为25μL； 所述PCR扩增程序为： 95℃预变性3min；95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环，每个循环降温0.5℃，最后72℃延伸6min。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述电泳条件为：1wt％琼脂糖凝胶、150V、100mA电泳20min。
6.一种利用权利要求1所述的多态性引物鉴定双峰驼亲子关系的方法，包括： 利用EDTA抗凝管采集具有亲子关系的双峰驼全血样品，然后采用核酸提取试剂盒法提取双峰驼基因组DNA； 将所述双峰驼转录组微卫星分子标记的多态性引物和所述基因组DNA混合并进行PCR扩增，得到扩增产物； 吸取所述扩增产物0.5-1.0μL与990μL HIDI和10μL LIZ500的混合物10μL进行混合，并将混合液在98℃、变性5min后置于冰水混合物上急速冷却，得到变性的混合液； 再将所述变性的混合液采用3730xl设备进行毛细管电泳，用GeneMapper 4.0软件进行分子量标准校对和微卫星基因型分型，最后对所述结果进行双峰驼亲子关系的分析。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述亲子关系的分析方法为：利用cervus 4.0软件中的Parentage Analysis程序计算每个驼羔与其亲生母亲或父亲之间的LOD值。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述亲子关系的判断标准为：当LOD值大于3时，假定的母驼或公驼是驼羔亲生父亲或母亲的概率为大于95％，当LOD小于-2时，假定的公驼或母驼与驼羔没有亲缘关系。
9.权利要求1所述的双峰驼转录组微卫星分子标记的多态性引物在双峰驼遗传多样性分析中的应用。
请联系平台
请联系平台
